Первый рабочий рейс — 26 декабря 1975 года по маршруту Москва — Алма-Ата, самолёт перевез почтовые отправления, а с 1 ноября 1977 года на том же направлении начались и пассажирские перевозки.
Начало пассажирской эксплуатации Ту-144 было приурочено к 60-й годовщине Октябрьской революции. Рейсы выполняли только два самолёта — № 77109 и № 77110. Пилотировали их специально подготовленные экипажи «Аэрофлота», в состав которых входили лётчики-испытатели ОКБ Туполева в качестве вторых пилотов, командирами воздушных судов были переученные пилоты «Аэрофлота». Билет на этот рейс стоил 80 рублей, тогда как на обычный дозвуковой самолёт билет в Алма-Ату стоил 62 рубля. Этот рейс получил № 499 (в направлении из Домодедово) и № 500 (в направлении из Алма-Аты), выполнялся раз в неделю по четвергам и являлся единственным из более чем десяти рейсов в Алма-Ату из Москвы, эксплуатацию которого осуществлял не Алма-Атинский авиаотряд Казахского управления гражданской авиации СССР, а Домодедовский отряд Московского авиаузла.
Коммерческая карьера Ту-144 была недолгой. 1 июня 1978 года, всего через семь месяцев после начала коммерческой эксплуатации, «Аэрофлот» прекратил сверхзвуковые пассажирские рейсы. Непосредственным поводом для прекращения пассажирских полётов послужила катастрофа опытного экземпляра Ту-144Д, произошедшая неделей ранее (см. ниже). Более основательной причиной отказа от пассажирской эксплуатации называется нерентабельность. Хотя билеты на сверхзвуковой рейс, цена которых была до полутора раз выше обычных, распродавались полностью задолго до вылета, они не покрывали даже незначительной части эксплуатационных расходов, вызванных высоким удельным расходом топлива в крейсерском режиме и сложным обслуживанием